产品目录

柠檬酸合成酶，即citroyl synthetase，又称柠檬酸缩合酶，在三羧酸循环（又称柠檬酸循环）中有非常重要的作用，因为它催化的反应是关键步骤。而三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，是三大营养素糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽和最终代谢通路。

三羧酸循环（英语：Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle），或柠檬酸循环（Citric acid cycle）或克雷伯氏循环（Krebs Cycle），是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸，因此得名；或者以发现者汉斯·阿道夫·克雷伯命名为克雷伯氏循环，简称克氏循环（Krebs cycle）。三羧酸循环是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。

在三羧酸循环中，反应物葡萄糖或者脂肪酸会变成乙酰辅酶A。这种“活化醋酸”（一分子辅酶和一个乙酰基相连），会在循环中分解生成最终产物二氧化碳并脱氢，质子将传递给辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黄素腺嘌呤（FAD），使之成为NADH + H+和FADH2。NADH + H+和FADH2会继续在呼吸链中被氧化成NAD+和FAD，并生成水。这种受调节的“燃烧”会生成ATP，提供能量。

真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是三羧酸循环的场所。它是呼吸作用过程中的一步，但在需氧型生物中，它先于呼吸链发生。厌氧型生物则首先遵循同样的途径分解高能有机化合物，例如糖酵解，但之后并不进行三羧酸循环，而是进行不需要氧气参与的发酵过程。

在三酸酸循环第一步反应中，催化乙酰辅酶A的乙基与草酰乙酸的酮基结合生成柠檬酰辅酶A，以便后续高能硫酸键水解，释放出辅酶A，得到柠檬酸。柠檬酸合成酶是一个调控酶，此酶的底物乙酰辅酶A和草酰乙酸是它的激活剂，NADH、琥珀酰辅酶A是抑制剂。

• 此方法灵敏度高，仅需微量样品即可测定。
  
• 操作方法简便、快速，测定结果准确稳定。

• 样本前处理：
  
  • 方法一：液氮研磨
    
    • 样本准备：取出新鲜组织或冷冻组织（4℃解冻或室温解冻），用冲洗液冲洗干净，滤纸吸干，准确称取组织重量100～300mg，加入液氮，快速用研磨棒碾碎组织成粉末状，备用。
      
    • 10%待测悬液制备：取研磨后组织粉末称重置于离心（1.5mL或2mL）管中，并按重量(g)：体积(mL)=1：9的比例加入9倍体积的提取液，涡旋混匀器剧烈混匀30秒，间隔2分钟，重复操作2～3次，制备10%待测悬液。放回冰槽环境回温。
      
    • 离心处理：将装有10%待测悬液的离心管置于4℃台式离心机，10000转/分钟，离心10分钟。
      
    • 10%待测上清制备：取出离心管置于冰槽环境，小心吸取10%待测上清液转移到新离心管（1.5mL或2mL）待测，同时用考马斯亮蓝试剂（或BCA试剂）测定蛋白浓度（我司有售）。
  • 方法二：机械匀浆（如不具备液氮操作条件）
    
    • 10%待测悬液制备：取出新鲜组织或冷冻组织（4℃解冻或室温解冻），用冲洗液冲洗干净，滤纸吸干；准确称取组织重量，按重量（g）：体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的提取液，冰水浴条件下机械匀浆，制备成10%待测悬液。
      
    • 离心制备10%待测上清：10000转/分，离心10分钟，吸取上清即为10%的待测上清液。同时用考马斯亮蓝试剂（或BCA试剂）测定组织蛋白浓度（我司有售）。
• 操作步骤：
  
  • 仪器准备：
    将酶标仪设定到待测波长（412nm），预温30min，使之各项指标参数处于较稳定使用状态。
    
  • 试剂准备：
    将冷冻试剂（底物液、显色剂）与冷藏试剂（缓冲液、阴性对照液）取出，平衡至室温后使用。
    
  • 样本准备：
    将待测样本置于冰槽回温平衡后待测。
    
  • 反应步骤（96孔板操作）：（附赠96孔板1块）
    
    • 取干净无菌96孔酶标板，置于试验台水平放置并标记待测样本编号，即U孔（或阴性对照孔，即O孔）；
      
    • 加入试剂一（缓冲液）190μL于96孔酶标板U孔（或O孔）中；
      
    • 加入试剂二（底物液）25μL于上述U孔（或O孔）中；
      
    • 加入试剂三（显色剂）25μL于上述U孔（或O孔）中；
      
    • 将加入上述试剂96孔酶标板轻摇混匀并置于37℃孵育箱3～5min；
      
    • 取出装有预温试剂的96孔酶标板，水平置于试验台；
      
    • 加入待测样本10μL于上述U孔中（或阴性对照液10μL于O孔中）（待测样本须澄清，冻存后复溶样本据情况需离心除去析出蛋白后再用）；
      
    • 轻摇该酶标板，使待测样本（或阴性对照液）与预温试剂充分接触；并将该操作96孔酶标板转入酶标仪，波长412nm，测定待测样本吸光度OD值，记为AU₀（阴性对照孔为AO₀）；
      
    • 将该96孔酶标板转入37℃孵育箱（或者在37℃恒温酶标仪）中温浴15min；
      
    • 再将该操作96孔酶标板转入酶标仪，波长412nm，测定待测样本吸光度OD值，记为AU₁₅（阴性对照孔为AO₁₅）；
      
    • 待测样本值（U孔）：待测样本吸光度AU₁₅—待测样本吸光度AU₀。
      【阴性对照值（O孔）：AO15-AO0】
• 简易操作：
  
  • 按下表加入各成分
    

    成分	阴性对照孔	待测样本孔
    试剂一	190μL	190μL
    试剂二	25μL	25μL
    试剂三	25μL	25μL
    轻摇混匀，37℃孵育箱温浴3～5min
    阴性对照液(μL)	10μL
    待测样本(μL)		10μL

  • 充分混匀（或96孔板以震荡混匀），并置于酶标仪中，波长412nm，测定初始吸光度A₀值；转入37℃孵育箱（或者在37℃水浴箱）中温浴15min，即刻放入酶标仪，测定吸光度A15。计算△A= A₁₅-A₀。

• 试剂及配制：由我司提供并按说明书配制。另取柠檬酸合成酶（CS）标准品，用双蒸水稀释成不同浓度，待测。
  
• 按说明书操作表进行测定。
  
• 按照标准品活力值为横坐标，绝对OD值为纵坐标绘制标准曲线：